分析中学生物实验中DNA提取的技巧_教学论文

分析中学生物实验中DNA提取的技巧: 来源: 查字典生物网| 2016-01-29 发表| 教学分类：教学论文

在中学教材中关于“DNA的粗提取与鉴定”这一实验的实际操作过程中,虽然现象明显,但存在几个问题:实验材料成本高[1],操作步骤较复杂,需要仪器较昂贵等。因此,一般中学很难开展[2]。针对上述问题,本实验做了部分改进分别选用新鲜的菜花和蒜黄作为材料,进行比较实验,试图达到材料来源广、试剂用量少、所需仪器少、操作更简单、结果较明显、一般普通中学均能开设的目的,从而有利该实验普及推广,让更多的中学生能从植物材料中提取DNA,增加学生的感性认识,提高学生的动手能力。

一、材料和方法

1.材料

菜花和蒜黄。

2.实验方法

以经典的SDS提取方法[3]为对照:

①分别称取在-20℃条件下保存的两种植物组织10 g,在液氮的冷冻下迅速研磨成粉末。

②加入提取液(100 mM Tris·HCl pH 8.5,100mM NaCl,50 mM EDTA pH 8.0,2%SDS)20 mL,充分研磨混匀,用两层纱布过滤,用移液器分别吸取5 mL滤液于10 mL的离心管中。

③将离心管置于65℃水浴中30 min,水浴过程中温和混匀几次。

④取出离心管,每管加入等体积的氯仿—异戊醇(V/V=1∶1)溶液,混匀后,10000 rpm离心10 min。

⑤小心将上清液移入另一离心管中,不要吸入杂质,重复步骤④,将上清液小心移入另一新的离心管中。

⑥加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀,静置一段时间。6000 rpm离心2 min,倒去上清液,吹干。

⑦用70%乙醇冲洗1次,然后用6000 rpm离心2 min。

⑧吹干后加入2mL的100×TE,溶解。

⑨贴上标签于-20℃冰箱保存。

对照上述步骤对DNA提取做表1处理。

3.鉴定DNA

①二苯胺鉴定法[4]

吸取各种处理的DNA溶解液0.75 mL于5mL的试管中,再加入0.75mL配好的二苯胺溶液,置于100℃沸水浴中10min,观察离心管中颜色的变化。二苯胺溶液中加入DNA后会变蓝,DNA所含量越多,蓝色就越深。

②分光光度计鉴定法

吸取各种处理的DNA溶解液0.5mL于比色皿中,加入1mL的水溶液,再在另一只同样的比色皿中加入1.5mL的水溶液作空白对照,测定不同处理的DNA在260nm和280nm处的吸光值[5]。

二、实验结果与分析

1.不同材料对DNA浓度的影响

菜花剪成小块不易研磨,可能存在研磨不充分,提取量少等问题,这样对DNA的浓度会有一定影响。而蒜黄剪成小段后,研磨明显比菜花充分,提取量较多,但蒜黄中含有的多糖物质较多,也会影响DNA的浓度。但就操作角度来看,采用蒜黄较好。

2.不同处理方法对DNA提取的影响

温度、液氮、氯仿—异戊醇和离心机等都是影响DNA提取的重要因素。因此本实验采用不同的处理方法来探讨DNA的提取,以达到优化实验的目的。

①温度对DNA提取很重要,低温能更好地保持DNA不降解,见表2。液氮可使材料研磨充分。

②氯仿—异戊醇起到了抽提蛋白质的作用,能很好地去除所提溶液中的杂质,最后提出来的DNA浓度和纯度均较好。

③用静置的方法代替离心机,比较符合现在许多中学的现状,即静置后小心用吸管吸取上清液转移到干净的小烧杯中,能够达到良好的提取效果。

④加入异丙醇沉淀DNA,沉淀效果更好,而且用量是0.6倍的上清液的体积,菜花和蒜黄的效果都比较好,总体效果比加2倍体积的无水乙醇得到的沉淀更多。

3.DNA鉴定

二苯胺鉴定法是中学常用的方法,此方法操作简单,现象明显。本实验中-20℃条件,氯仿—异戊醇的处理和异丙醇沉淀的DNA含量较多,能使二苯胺溶液变得较蓝。说明DNA含量较高,通过分光光度计检测260nm/280nm为1.75~2.0之间,纯度较高,达到实验的要求。

三、讨论

提取DNA的方法有许多,常见的有CTAB法和SDS法等。但由于所用材料及中学实验条件的限制,所提取的效果不尽如人意。本实验从中学实验条件着手,就DNA的SDS经典提取方法中有几处中学实验条件达不到的步骤做了不同处理。

经过反复实验,实验材料采用蒜黄和菜花,在-20℃条件下,采用静置的方法处理并用冷的异丙醇沉淀DNA,得到的DNA浓度和纯度都较高,已经能达到中学的要求,能较好地观察到提取出来的DNA。经过比较最终得到一种最适合于中学DNA提取实验的方法,即采用蒜黄为实验材料,在-20℃条件下,不用液氮,不用离心机而采用静置,加入氯仿—异戊醇的方法。

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