由于人体组织器官的病变、损伤及衰老导致的器官功能失用等，造成临床上组织器官替代治疗出现巨大的缺口。生物人工器官的研究一直是再生医学研究的热点，有着巨大的临床应用前景。为了实现对天然器官功能替代，有2个主要终点需要实现：生成正确的成分细胞类型，建立一个有生理特性及功能的立体组织架构，对于相应的器官来说，二者均具有高度的特异性。

近年来，有多种研发策略在该领域创造了一个良好的开端，为移植生物人工器官提供了理论上的可能性。目前，主要的3种策略包括：（1）全器官脱细胞及基于体现器官特异性的天然细胞外支架的器官再生；（2）将不同细胞类型通过自组装，形成特异性的结构，最终形成类器官；（3）基于计算机辅助基质支架构建的3D器官打印和所需细胞类型的定向植入。现就其研究进展综述如下。

1．全器官脱细胞及再细胞化：

组织工程是根据生命科学和工程学的原理，应用具有特定生物活性的组织特异细胞与生物材料相结合，在体外或体内构建组织、器官或其生物性替代物，以维持、修复或再生损伤组织和器宫功能的一门科学。随着组织工程技术的快速发展，越来越多的学者意识到，应该采用种子细胞一支架材料一生物反应器的工程化体外器官再生模式，直接从组织水平进行器官再生重构。

该策略的实施需要3个最基本的条件：具有特异性的功能细胞（种子细胞），理想的含有细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白的生物支架及高度模拟体内状态的生物活性环境。其中，生物支架需要为组织修复和种子细胞的生长及发挥其生物学功能提供适宜的空间和微环境支持，作为体外组织器官再生的基本要素，能最好地模拟体内环境的生物支架的构建显得尤为莺要。支架能为种子细胞提供生长、繁殖、新陈代谢、物质交换的场所，可有效控制移植细胞的生长位置。

支架可引导组织的再生，其大小和形态对组织的结构和功能均有重要影响，其可为新生组织提供机械支撑作用、抵抗外来压力、维持组织原有的形状完整性；此外，支架还可以作为活性因子的载体，缓释生长因子等生物活性物质，促进细胞的生长、增殖及分化。ECM是一个复杂的网络结构，在不同的组织中，ECM发挥着不同的生物学功能。

全器官脱细胞是通过将除垢剂经天然血管进行灌注，移除所有的细胞成分，留下完整或部分完整的ECM支架。非常重要的是，脱细胞器官独特的三维结构及孔隙需要较好地保留，其仍有活性，是细胞生长的理想环境，可以使不同的细胞迁徙定植到其生理位置。最近有学者通过生物工程的方法，将器官特异性的细胞选择性地灌注到靶器官的ECM支架中，成功在体外生成有功能的生物人工心脏、肺脏和肾脏等。

这是第一次通过生物工程的方法，在不存在自体细胞的组织特异性全器官去细胞基质中生成有功能的生物人工器官。有研究将生物人工器官再次植入到模型动物的体内，并模拟肺脏的换气功能、肝脏的代谢功能及。肾脏的泌尿功能等相应器官的功能。

目前，再生策略已应用到大型动物和人类的研究中。许多策略都可以实现对器官的脱细胞化，但是具体采用哪种方案和试剂配比进行脱细胞，能够完全去除器官内的细胞成分，又最大程度地保留ECM，还没有达成共识。

2．类器官工程：

类器官工程是一项正在兴起的技术，是在3D培养的条件下从胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）或者诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化构建的一个迷你器官，或称“类器官”。通过这种途径，已经有小肠、垂体、甲状腺、视网膜，以及最近的脑，实现体外类器官的生成。这些研究突出了3D培养中分化细胞的自组装能力。

通过3D培养人iPSCs衍生的肝脏细胞、内皮细胞、间充质干细胞生成的血管化类肝脏器官，可以模拟天然肝脏结构及功能的多个方面。这些研究强调了间充质细胞在器官构建中的重要性，并且证明了不同细胞类型在器官形成中协同组装的固有能力。类器官工程可以认为是对传统2D培养模式的一种补充，可以加深我们对器官发育的理解，并且能促进对相关机制的研究及药物筛选的疾病模型的建立。

从再生医学的角度来看，当提供合适的3D培养条件，这些迷你器官的形成显示出个体细胞令人瞩目的自组装能力。在从这些类器官中生成可供移植的生物工程类器官之前，还有许多问题需要解决。尽管这些类器官可以模拟天然器官的多个方面，甚至如人脑般复杂的结构，但其仍然是相对简单的结构。

将类器官的规模从目前的毫米级升级到临床应用的大小是首要问题。为了使类器官具备成熟器官样的复杂度和层次，需要结合支持支架或结构指引细胞的定向自组装。在发育中，许多器官是通过模块化的方式组装，以互相连接的方式形成功能单元，如人类的肺脏有大约5亿肺泡，这些功能单元体积较小，功能相对简单。通过自组装方式构建功能单元或一个集簇的单元，也可通过类器官工程实现。这些单元可以作为构建模块，进而实现后续的器官工程。

3．3D生物打印：

许多组织工程策略是基于生物支架的，细胞在其上黏附、存活并发挥功能，从而形成具有活性的器官。不同于使用脱细胞技术的天然器官支架，生物打印技术生成3D支架是通过层层叠加的机械方式制作出来的。设计策略是，明确目标器官的关键结构构成特点，将其内外部特点进行分解后，形成一系列平行的切片。这些切片为进一步的制作提供了模版。

间接生物打印是通过3D打印生成模式化支架后，将种子细胞再植到打印的支架上，但将细胞有效、均质地输送到支架中仍然具有挑战，特别是对于构建实质性组织和器官。直接生物打印是将细胞结合的支架材料和细胞同时进行打印，通过同时结合细胞和支架材料的方式跨越了间接生物打印的障碍；相较于传统的使用模具的支架构建方法，这种采用叠加构建的3D支架打印技术，可以精确地控制支架内部的架构，并具有很好的重复性。可以进一步有效地筛选和优化包括支架的孔隙率、孔隙大小及渗透性等结构变量，这些均是决定后续细胞定植及组织再生的重要因素。该技术更具前景的优势在于其可以结合生物活性分子；可以在支架打印或者后续细胞输送的过程中，根据预定的模式和浓度梯度添加生长因子和细胞黏附分子；可以实现控制后续再植细胞的行为。

在直接生物打印中，整个制作过程需要具备生物相容性，且没有细胞毒性。非接触式喷墨打印是常用的方法，但是其空间分辨率较低。目前，通过3D生物打印出的移植物规模仍然较小，结构相对简单。若要打印具有更加复杂体系结构的移植物，并且接近天然器官的规模，必须进一步改进直接细胞打印的分辨率和级别。更为重要的是，对于目标器官的细胞及ECM的构造必须有更深的认识，才能更好地模拟天然器官的层次体系结构。

4．中枢神经系统体外再生研究：

到目前为止，国内外还没有中枢神经系统（central nervous system，CNS）组织器官体外再生的报道。CNS特殊而复杂的生理功能和解剖结构对应用于再生研究的组织工程策略提出了极高的要求。在CNS内，ECM大约只占总组织体积的20%，但分布相当广泛，ECM形成基底膜贯穿整个中枢系统，包绕着脑组织和血管，通过受体的介导与神经干细胞、神经元、胶质细胞及内皮细胞相互作用，参与脑组织的生长、发育及发挥其生理学功能。在基于脱细胞的CNS再生研究中，不同于皮肤、血管、韧带、肌腱等韧性较强的组织，CNS组织结构疏松、质地柔软、机械强度较弱。应用传统的脱细胞方案，在脱细胞过程中，CNS的ECM组成成分及三维网状结构极易受到破坏而失去原有的排列方式。

目前，尚元公认的CNS脱细胞方法。用于CNS再生的脱细胞支架需要具有与正常CNS高度一致的大体形态和天然的三维空间结构，可为种子细胞的黏附、生长、迁移提供框架结构，且元明显的免疫原性。旨在促进CNS再生的脱细胞支架的研究策略大部分利用的是周围神经及非神经组织，但也有部分研究使用中枢神经脱细胞支架，但大多是早期的尝试。

已有研究通过化学处理或冷冻干燥法与化学方法相结合，实现大脑、脊髓或视神经组织的脱细胞。脱细胞支架包含层黏连蛋白、纤连蛋白和生长因子[血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。脱细胞CNS支架具有促进小鸡胚胎绒毛膜尿囊膜的血管生成，促进神经细胞在体外的扩散、迁移及分化，皮下移植后不引起体内免疫反应的作用。但其类似于周围神经脱细胞移植物，不能完全清除髓磷脂，这将阻碍CNS来源的ECM支架移植进入CNS后的获益。

Lancaster等在旋转的生物反应器巾采用低水平的碱性成纤维细胞生长因子诱导人类ESC和iPSCs，进而在神经培养液中进行3D培养，培育出一个类似9~10周胚胎的大脑类器官。旋转的生物反应器能改善生长中器官的营养吸收，形成连续长条形的神经上皮样区域及外层室下区样前体区域。

在发育初期，已经拥有人类大脑的一些主要区域及类似中脑和后脑等区域可辨认的特征，包括背侧皮层、腹侧前脑及脉络丛。但缺少9周胚胎大脑的一些确定特征，例如与运动有关的小脑，也极少发现与记忆相关的海马状突起；同时，通过对照实验发现，正常ESC和神经发育小头畸形来源的iPSCs在类器官的形成上并没有明显差异，这也为脑发育的研究提供了一定的思路。借助于类器官能够解答与大脑发育及最初发育阶段出现的紊乱有关的一些问题。

大脑类器官的培育是体外大脑再生的重要突破，但类大脑器官只具备形态上的模拟，并不具备功能上的作用。

5．小脑再生的策略：

小脑是脑组织中相对独立和特殊的区域，在运动控制中发挥着重要的作用，在认知功能领域，如注意、语言、调节恐惧及愉悦的应答中也发挥一定的作用。其位于大脑半球后方，覆盖在脑桥及延髓之上，横跨在中脑和延髓之间，解剖位置相对独立，易于显微解剖分离。在某些特殊的情况下，人类可以在小脑缺如的情况下长期生存。存小脑蚓部和半球表面有一些横行的沟和裂，将小脑分成许多回、叶和小叶，是其特异性的形态表现。

相较于大脑皮质的6层结构，小脑皮质由外向内分为分子层、浦肯野细胞层及颗粒细胞层。相较于大脑的多种神经元，小脑神经元主要有星形细胞、篮状细胞、浦肯野细胞、颗粒细胞和高尔基细胞。由于小脑功能较单一，发育周期长，较易受环境变化的影响，损伤后无致死性、症状明显，最为重要的是，小脑半球的部分切除并不会造成机体严重的功能障碍。所以小脑成为研究发育、突触起源及细胞死亡机制很好的模型，也成为研究CNS组织器官体外再生的突破点。

作为CNS再生的一个重要领域，小脑的体外再生也取得了许多进展。日本理化学研究中心发育生物学研究所成功诱导人类ESC自组装，并使其发育成一个类似于小脑的三维功能性结构，具有特征性的背一腹式花纹和多层结构，与自然发育的小脑相同。在特殊环境下，用碱性成纤维细胞生长因子培养人类ESC，3周内定向分化为中脑/后脑区，5周内表现出小脑板神经上皮细胞特征，15周后，细胞的电生理学记录显示其有适当特异性反应，表明功能发育随着结构成型而完成。自组装小脑类器官的出现对于将来的人工小脑的构建非常重要。尝试用人类iPSCs生成小脑已取得了一些突破，对构建小脑疾病模型具有启示作用。

采用天然的小脑脱细胞支架作为小脑再生的支架材料具有独特的优势：具有最接近小脑组织的三维结构，生物力学性能与正常小脑相似；能为神经通路的重建提供生理相似的通道，从而正确引导其生长；支架表面具备细胞膜受体识别位点和部分活性因子，有利于细胞的黏附生长及发挥生理功能；工程化的种子细胞（如重编程的类小脑细胞等）既能分泌多种神经营养/生长因子，又能促进新的细胞外基质形成，提供再生引导信号；具有良好的生物相容性。复旦大学附属华山医院神经外科已采用生物工程的方法构建生物人工小脑支架，该生物支架具有与正常小脑高度一致的形态和天然三维空间结构，可为种子细胞的黏附、增殖、迁移及分化提供框架结构；同时具有良好的生物相容性，可用于小脑再生的相关研究，为再生医学的研究提供了一种方法和工具。进一步的研究将关注在体外再生过程中脑组织血供的供给及种子细胞的选取。

6．生物人工小脑构建的挑战：

首先，种子细胞的来源途径有限，以往常采用胚胎来源的细胞，但受到伦理学的限制。随着干细胞生物学，特别是iPSCs技术的发展，从患者自体来源的细胞生成“个性化”生物人工器官种子细胞已经有了可能性。2010年，Vierbuchen等∞毗首次在体外将小鼠胚胎和成体成纤维细胞直接转化为具有功能的神经元，这种方式被称为体细胞因子介导的谱系重编程。随后，有多个研究中心通过不同的因子或小分子组合及改良转化策略，将小鼠和人的成纤维细胞直接转导，获得神经前体细胞或神经元。谱系重编程的方式为通过重编程技术获取特异性的种子细胞提供了新的途径。要达到人类小脑规模的再生需要非常大量的细胞，需要在转分化期间或之后纯化丰富所需的细胞类型。需要解答的是，从二维扩增到三维器官培养的转变过程中，何时是细胞再植的理想阶段。

一旦将种子细胞种植到支架上，体外培养条件（生物反应器）是该3D多细胞结构最终形成功能性组织并成熟的关键因素。适宜的体外培养条件需要具备：能够支持细胞的新陈代谢、促进细胞一细胞问和细胞一支架间的交互、促进组织/器官功能的发生。若正常代谢的组织植入物的体积超过3 mm3，则需要有可供灌注的血管网络，以供应组织存活及发育必要的养分。因此，在CNS器官再生过程中，可以支持高效的氧和培养基灌注的功能血管的再生，是体外长期培养过程中维持细胞代嫩和生存的先决条件。

全器官脱细胞法通过主要血管灌注除垢剂的方式，为器官再生保存了基底膜完整的无细胞血管床。因此，可以通过在脱细胞支架上经主要动脉再植内皮细胞实现血管再生，在既往的血管路径上实现再内皮细胞化，构建具备器官特异性的复杂血管层次结构。然而由于CNS组织构成的特殊性，保留血管结构在CNS脱细胞过程中具有极大的挑战。在3D生物打印中，通过将内皮细胞播种到3D碳水化合物玻璃纤维网络上，生成模式化的血管网络。去除模板后，可以在血管网络中实现高压灌注下的血流搏动，并支持血管周围空间内其他细胞的生存。

7．再生器官应用临床前评估：

器官工程的最终目标是植入生物人工结构，来增强或替代缺失的组织和器官的功能。为了保证患者的安全，在进入临床应用之前，需要在动物模型上测试并优化生物人工器官的体内表现。首先，移植物的血管化需要进一步完善，并具备适当的屏障功能，避免凝血或出血；其次，确定体外成熟的程度对长期移植成功是有必要的；再次，需要开发免疫抑制策略，优化体内移植物的长期性能。使用人类细胞培养的体外再生器官已被移植到无胸腺的啮齿类动物模型。然而免疫系统的其他成分，如巨噬细胞，也可能参与对组织工程支架再生器官植入后的免疫反应，需要进一步优化这些成分引起的免疫抑制策略。

生物人工器官代表结合了细胞、支架和其他因素的复杂产品，需要确保安全性和有效性。在转分化细胞临床应用前，也有几个问题需要关注。首先，传统产生方式涉及病毒介导的细胞重编程因子的转导；第二，不同的iPSCs系的分化能力高度可变，需要仔细鉴定新生成的细胞株的多能性和分化潜能。第三，转分化细胞存在高水平的突变负荷，大多数有丰富的基因突变或有诱发肿瘤的可能。应用前需要对这些细胞的性质、纯度和功能成熟进行确认，同时需要严格控制支架的微生物负荷，深入评估生物的相容性。

8．结论和展望：

生物人工器官工程需要将重点放在研发具有生理功能的移植物上。在此，以全器官脱细胞小脑再生为例，在细胞向器官的构建中需要4个层次的功能测试。第1层的功能测试是在细胞和支架组合之前（神经元的特征和适合突触连接建立的支架）；第2层是器官不同组织单元的功能测试（神经元在支架内与周围的神经元建立突触连接并传递电活动）；第3层是有多个组织单元的再生器官的综合功能的体外测试（小脑皮质典型的3层结构的形成，神经元间有电活动）；最后一层是再生器官移植后的体内功能测试（移植后的生物人工小脑与受体小脑结合并传递电活动）。阶梯式层次结构的功能测试将明确节点的定义，可以在每一阶段上指导技术的优化，最终实现功能替代器官的生成以及临床使用。

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