拼接组建真核载体的基因变化_教学论文

拼接组建真核载体的基因变化: 来源: 查字典生物网| 2016-02-01 发表| 教学分类：教学论文

引言ADAM10为同时具有解整合素和金属蛋白酶两种结构域的Ⅰ型跨膜蛋白,是ADAMs(ADisintegrinandMetalloprotease)家族的重要成员,广泛存在于各种组织细胞中,主要负责水解脱落多种跨膜蛋白的胞外结构域,其水解底物包括Ⅳ类胶原蛋白、EGF、betacellulin、TNF-α、Notch、CD23、CD89、CD44、CAM1、E-cadherin和N-Cadherin,具有α分泌酶活性参与APP的水解代谢等,在众多生理病理活动发挥重要作用[1-4]。本文拼接构建ADAM10真核表达载体,为进一步研究ADAM10的生物学功能提供材料。在构建过程中,观察到罕见的目的基因在大肠杆菌DH5α为宿主菌时插入增加512bp的突变现象,后通过更换克隆宿主菌株的办法予以克服,报告如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料人ADAM10基因全长2247bp(含终止密码TAA),位于序列910bp处有唯一一个EcoRⅠ酶切位点,以该点为界,可将全长分为上下游两个部分,先期分别克隆了上下段序列的载体由作者实验室保存,其中下段载体中ADAM10序列C末端已引入XhoⅠ酶切位点。通过PCR引入HindⅢ和EcoRⅠ位点获得用于拼接ADAM10全长的ADAM10上段基因序列,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切含目的基因的克隆载体获得ADAM10下段基因序列(见图1)。大肠杆菌E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3),pcDNA3.1真核表达载体由作者实验室保存。

1.1.2试剂引物合成与测序为上海英骏生物技术公司,主要引物为P1:5’-TAGAAGCTTGCCACCATGGTGTTGC(含HindⅢ位点),P2:5’-CTGCTCAGAATTCAATTCCAG(含EcoRI位点),P3:5’-TTAGCGTCTCATGTGTCC-3’,其中P1/P2用于扩增ADAM10上片段,P1/P3可扩增ADAM10基因全长。TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ和XhoⅠ等为大连宝生物公司产品。DNA凝胶回收试剂盒为AXYGEN(爱思进)公司产品。

1.1.3仪器图1pcDNA-ADAM10真核表达载体构建图Fig.1ConstructionofpcDNA-ADAM10recombinantplasmid美国PE-2400PCR扩增仪;上海培清JS-380A凝胶成像系统;北京六一DYY-Ⅲ2型电泳仪。

1.1.4培养基LB培养基,LB固体培养基,按需要加入氨苄青霉素(100mg/L)。

1.2方法

1.2.1ADAM10基因上半段与pcDNA3.1的连接以ADAM10上半段克隆载体为模版,用P1/P2引物扩增出ADAM10上半段序列,PCR产物经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,回收纯化后与同样双酶切的pcDNA3.1表达载体相连接,常规CaCl2法转化感受态DH5α,涂含氨苄青霉素的LB平板,通过PCR、酶切和测序筛选鉴定阳性克隆,命名pcDNA-AD-AM10(up)。

1.2.2ADAM10基因下半段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并转化DH5α用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切含有ADAM10基因下半段的克隆载体,回收纯化后与同样双酶切回收的pcDNA-ADAM10(up)重组载体片段相连,CaCl2法转化感受态DH5α,提取单菌落质粒,用EcoRI和XhoⅠ进行双酶切,用PCR以P1/P3引物扩增ADAM10基因全长,全长PCR产物再用EcoRⅠ单酶切,最后测序等方法筛选鉴定阳性克隆,命名pcDNA-AD-AM10(up+down)。

1.2.3ADAM10基因下半段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并转化BL21(DE3)步骤同1.2.2,仅将感受态菌由DH5α换为BL21(DE3)。鉴定完全正确的连有ADAM10全长基因的重组质粒命名pcD-NA-ADAM10。

1.2.4pcDNA-ADAM10全长重组质粒转化DH5α后的稳定性将在BL21(DE3)中构建正确的pcDNA-ADAM10再转化DH5α,提取转化菌落的质粒,然后用PCR和酶切鉴定,步骤同上。

2结果与分析

2.1ADAM10基因上半段与pcDNA3.1的连接ADAM10基因上段与pcDNA3.1连接后转化DH5α,阳性克隆经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切可得到大小约910bp和5.4kb的预期带,PCR扩增ADAM10基因上半段也可以得到约910bp的预期带(见图2),测序结果显示ADAM10基因上段与pcD-NA3.1的连接完全正确,无任何突变。

2.2ADAM10基因下半段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并转化DH5αADAM10基因下段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并转化DH5α后,经反复筛选试验,所有拼接连入ADAM10基因下段的重组质粒pcDNA-ADAM10(up+down)均出现异常,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切可得到大小约6.3kb的载体预期带,但预期约1.3kb的ADAM10基因下半段没有出现,取而代之的是一条约1.8kb的带。用PCR扩增ADAM10基因全长也没有得到约2.2kb的预期带,而是约2.7kb的带,将此PCR扩增产物用EcoRⅠ单酶切,可见约910bp的ADAM10上段带,而另一条带约1.8kb(见图3)。通过对重组质粒正向和反向测序分析,结果发现ADAM10下段出现插入增加512bp的突变,插入序列本身就是ADAM10下段序列的一部分(位于ADAM10全长的第1531bp~2042bp间),其位置相当于被紧邻连续复制了一份(见图4,为反向测序结果,划线部分标示了插入增加的512bp碱基和XhoⅠ酶切位点)。

2.3ADAM10基因下半段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并转化BL21(DE3)ADAM10基因下段与pcDNA3.1-ADAM10(up)重组质粒连接并转化BL21(DE3)后,阳性克隆经EcoRI和XhoⅠ双酶切可得到大小约6.3kb的载体预期带和预期约1.3kb的AD-AM10基因下段带。PCR扩增ADAM10基因全长可得到约

2.2kb的带,将此PCR扩增产物用EcoRI单酶切,可见约910bp和1.3kb两条带(见图5)。通过测序分析,结果显示整个目的基因没有任何突变,ADAM10全长真核表达载体pcD-NA-ADAM10拼接构建成功。2.4pcDNA-ADAM10全长重组质粒转化DH5α后的稳定性将构建正确的pcDNA-ADAM10再转化DH5α,扩增后提取质粒进行PCR和酶切鉴定,结果与2.3一致,没有出现2.2中的ADAM10下部分片段连入载体后增大的情况,说明构建好的pcDNA-ADAM10全长在DH5α可以保持稳定性,不再出现ADAM10拼接过程中在DH5α中发生的目的基因插入突变增加512bp的现象。

3讨论

人ADAM10蛋白由748个氨基酸残基组成,按其功能可分为信号肽区、前肽区、金属蛋白酶区、解整合素区、富含半胱氨酸区、表皮生长因子样区、跨膜区和胞浆区,成熟的ADAM10蛋白需在前体蛋白转换酶(proproteinconvertase,PCs)等的作用下,将其前肽结构水解去除才具有活性。ADAM10在生命活动中不可或缺,其作用贯穿精子发生、胚胎生长发育、突触形成、细胞存活与凋亡等各个环节,如ADAM10激活Notch信号途径促使心血管发生[5],激活N-Cadherin信号途径调控突触形成[6]。ADAM10表达或活性失调也会严重影响机体组织和器官的正常功能,与炎症、神经进行性退变以及肿瘤的发生发展和侵袭转移等病理改变有密切关系[7-9],因此,深入研究ADAM10基因的表达调控及作用机制,可为许多相关疾病的诊断治疗提供新的思路。本文构建ADAM10真核重组质粒时,根据真核表达载体pcDNA3.1阅读框有依次排列为HindⅢ、EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点,通过HindⅢ和EcoRⅠ位点连接ADAM10上半段、通过EcoRⅠ和XhoⅠ位点连接ADAM10下半段,从而拼接出ADAM10全长序列。一般来说,拼接时先连上半段再连下半段,或先连下半段再连上半段,不会影响拼接结果。但实际拼接时,先连下半段很容易成功,但随后再连上半段的效率似很低,很难得到阳性克隆。改用先连接ADAM10上段再拼接下段时,若连接产物转化常规使用的DH5α感受态,则出现连接的下段基因片段明显增大的情况。分子克隆实验中,目的基因与载体连接转化大肠杆菌后,重组质粒随细菌的增殖会在菌体内大量复制,这时质粒发生点突变的几率都会很小,出现大段序列增加或缺失突变则更是极其罕见。然而,本文观察到当用DH5α为感受态转化连接产物时,出现下段序列插入突变增加多达512bp碱基的奇怪现象。此外,我们在尝试将ADAM10上下两段依次与其他真核表达载体相连拼接过程中,还出现了目的基因缺失的结果,如先连好上段再连下段,可出现下段缺失147bp的情况;若先连好下段再连上段,可出现上半段缺失368bp的情况,更有甚者还出现整个连入的上段被与上段长度相当的非目的序列所置换的现象(资料未显示)。

当尝试用BL21(DE3)为感受态转化连接产物时,则可以获得拼接正确的ADAM10全长重组质粒,将此质粒再转化DH5α后,质粒没有出现目的基因增加现象,说明该重组质粒可以在DH5α中稳定扩增。因此,尽管在发生ADAM10下半段基因增加突变的多次亚克隆试验中,凡是疑似连入了下片段的DH5α菌落全部被挑选出来进行反复鉴定,结果插入的基因片段都是同样增大,我们仍然猜测不排除会有少量拼接克隆没有发生突变,只是几率太小而没有筛选到。总之,在载体构建过程中,如本文发生大段目的基因增加或缺失突变的情况罕有发生,亦未见相关报道,推测在拼接构建ADAM10重组质粒的过程中,容易发生基因重组现象,其具体过程及机制不明,可能涉及感受态菌株、目的基因片段、载体序列和连接反应液等多个因素的相互作用。大肠杆菌DH5α是常用的重组质粒构建工程菌,而BL21(DE3)由于染色体整合有T7聚合酶基因而通常用作T7原核表达系统的宿主菌,本文用BL21(DE3)作为载体构建的宿主菌以克服在DH5α中的突变,尽管机制不明,但提示在特殊情况下,该菌株有利于重组质粒的构建。

【拼接组建真核载体的基因变化】相关文章：