山葡萄(V.amurensisRupr)亦称东北葡萄,分布于我国东北、华北以及俄罗斯远东地区和朝鲜半岛,是我国重要的野生果树资源。山葡萄对严寒具有极强的抗性,并且浆果果香浓郁,风味独特,因而成为我国东北酿造葡萄酒的主要原料。山葡萄作为葡萄属中最抗寒的一个种,是典型的非跃变型果实,其生长动态表现为双“S”曲线特点。根据果实在不同时期的生长特点和生长快慢,将浆果的生长发育分为三个阶段:第Ⅰ、Ⅲ期为快速生长期,第Ⅱ期为缓慢生长期,处于第Ⅱ期末和第Ⅲ期开始之间的时期称作转色期(Veraison)。转色期是葡萄学家描述浆果成熟生长和颜色改变的开始,它是一个形态(大小、硬度、色泽)和内部生理生化呈现剧烈变化的时期,其表现为生长加速,浆果开始软化并伴随着可溶性糖含量的增加和有机酸含量的下降;表皮叶绿素发生降解并逐渐消失,红色品种的花色素开始积累,与香气、味道有关的次生化合物也开始生成。

cDNA文库是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具,反映的是来源细胞当时基因组表达出的基因序列信息。因而可以从cDNA文库中筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。cDNA文库在研究特定类型细胞基因组的表达状态以及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势。从cDNA文库中随机挑取克隆,从5′或3′端测序获得150~500bp的短序列称为表达序列标签(ExpressedSequenceTags,ESTs)。将获得的EST序列与数据库中的序列进行比较,获得对基因组结构、表达等认识的基因组研究策略被称为植物表达序列标签(EST)计划。EST反映的是基因的编码部分,所以EST计划可以直接获得基因表达的信息。本文采用Clontech公司的cDNA文库构建试剂盒以pDNR-LIB为载体,构建了山葡萄转色期果皮的cDNA文库。从而提供了在分子生物学角度上研究山葡萄果实品质形成、产量形成及采收期的选择提供了理论的依据,为在分子水平上更深层次的研究相关成分的生物合成机理、抗病的分子机制及相关基因的克隆,筛选积累基础材料。

1材料与方法

1.1材料

山葡萄品种‘双丰’(V.amurensiscv.ShuangFeng)采自中国农业科学院特产研究所国家山葡萄种质资源圃。在果实转色期(50%着色)采摘,材料采后洗净擦干,立即置于液氮中冷冻,于-80℃冰箱保存,取果皮作为供试材料。

1.2试剂

CreatorSMARTcDNA文库构建试剂盒购自Clontech公司;感受态细胞EscherichiacoliElectro-cellsDH5α和DNAmarkerDL2000均购自TaKaRa生物技术公司;RQ1RNase-FreeDNase购自Promega公司;其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.3总RNA的提取

山葡萄果皮总RNA提取采用改良的CTAB法,对提取出的总RNA进行纯化。具体步骤如下:将沉淀后的RNA用40μlDEPC水溶解,分别加入5μl10×ReactionBuffer,5μlDnase(8:1:1),混合均匀,稍离心,37℃消化30min;加DEPC水至总体积300μl,再加300μl氯仿抽提一次,取上清加入3倍体积的无水乙醇,1/10体积的3mol·L的NaAc,-20℃沉淀30min;于4℃下以13000r·min离心30min,弃上清,沉淀用75%乙醇洗涤2~3次,真空或自然干燥,再用DEPC水溶解,置于-70℃下保存备用。以1.1%的琼脂糖凝胶上电泳检测RNA的纯度和是否降解,用紫外分光光度计测定含量。

1.4cDNA文库的构建

文库具体操作

步骤参照CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit说明书进行。取1μL总RNA(约1μg)用于合成cDNA第一链,取2μL单链cDNA做模板进行长距离PCR(LD-PCR)。反应参数为:95℃中预变性1min;95℃变性15s,68℃延伸6min,共24个循环;至4℃时结束反应。引物为:SMARTIVOligonucleotide:5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′;CDSⅢ/3′PCRPrimer:5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)NN-3′;5′PCRPrimer:5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′。取5μLPCR产物在1.1%琼脂糖凝胶电泳观察双链cDNA的分子量分布情况。

取50μL双链cDNA,用蛋白酶K消化,再以SfiI酶切,然后用CHROMASPIN-400Column过柱分级分离并回收纯化。将回收的双链cDNA与经SfiI酶切的去磷酸化的pDNR-LIB载体分别按1:2、1:1、1:1.5体积比连接(表1),16℃过夜。反应结束后,通过电穿孔将含有cDNA的质粒载体转化到感受态细胞DH5α中。

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